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ATCC细胞在培养瓶是怎么培养的?

某些ATCC细胞,是在培养瓶中以活细胞的形式运输的。这些培养瓶中会接种细胞,孵育并保证细胞能生长,然后补充满培养基后再运输。

 在收到培养瓶后,目视检查培养基是否污染。包括异常的pH变化(苯酚红变为黄色或紫色),浑浊度,或有无颗粒。在低倍率(100×)的倒置显微镜下观察培养基中是否有微生物污染以及细胞的形态。

如果细胞是单层贴壁生长:
1.无菌操作,取出大约5至10ml的运输培养基。运输培养基可以保存在4℃备用。
2.将培养瓶放在产品说明书中推荐的温度和CO2浓度下培养(大多数细胞系为37℃与5%CO2)直到细胞可以传代培养。


如果细胞不贴壁或是悬浮状态生长:

1.在无菌条件下,将培养瓶的全部内容物转移到离心管中。
2.在125×g转速下离心5~10 min。
3.取出大约10 ml运输培养基的上清液,并重悬细胞。将取出的运输培养基储存在4℃备用。
4.无菌条件下,转移悬浮细胞到25 cm2或75 cm2的培养瓶中,培养瓶大小取决于细胞株(见产品说明书)。
5.按照产品说明书中推荐的温度和CO2浓度培养细胞,直到细胞可以传代培养。
 
原代ATCC细胞来源于一块碎的或酶消化的组织。原代培养物,是多种类型细胞的混合物,保留了其来源组织的特点。
 
一段时间后,原代培养的细胞会达到融合状态,即在培养瓶中的所有可用空间由于细胞扩增都被覆盖。在此之后,ATCC细胞需要消化(通常用蛋白水解酶,如胰蛋白酶)为单个细胞并且传代(分裂,传代或转移)。在第一次传代以后,培养物通常被称为一个细胞系。每一次传代培养,细胞群体由于快速生长的细胞占主导地位而变得更均匀。具有所需特性的细胞也可以通过克隆,从培养物中选出。
 
二倍体细胞很少可以倍增超过几代。它们只有有限的复制能力,并且在细胞倍增20至80次后开始减缓并最终停止分裂。最近的证据表明,某些细胞中观察到的细胞衰老与预计的复制性衰老不同,可能是由于不适当的培养条件导致的。还有其他数据显示,对某些物种的细胞系(尤其是人源的)即使生长在改进的培养条件下仍存在复制衰老。这种衰老是由细胞分裂时染色体末端(端粒)缩短调控的。
 
相反,传代(或永生化)细胞具有无限增殖能力。这些细胞系通过多种手段中的其中一种来使细胞永生化或转化。许多传代细胞来自肿瘤组织。ATCC收集的大部分细胞系是传代的,只有少数如CCD-1117Sk人皮肤成纤维细胞(ATCC CRL-2465™)或CCD-18Co人结肠细胞(ATCC CRL-1459™)是有限传代的。更多关于ATCC细胞永生化的信息可以在ATCC网站上查找。
 
正如以上提到的,细胞系要么在培养瓶表面贴壁生长(锚定依赖性)要么悬浮生长(非锚定依赖性)。ATCC细胞的生长和分裂,通常遵循一个由四个阶段组成的特征性增长模式:停滞期,对数期(指数期),平稳期(平台期)和衰退期。
 
停滞期——将细胞接种至培养瓶之后,细胞逐步恢复的同时,缓慢生长。
对数期(指数期)——细胞进入一个对数生长的时期,一直持续到整个生长表面被占满或细胞密度超过培养基提供营养的能力。
平稳期——细胞增殖减慢或停止。
衰退期——如果不更换培养基且细胞数量不减少,细胞活力会下降,并出现细胞死亡。

为了确保ATCC细胞活力,遗传稳定性和表型稳定,必须使细胞保持在对数期。这意味着细胞需要在进入平稳增长阶段之前,或在单层细胞长成100%融合之前,或在悬浮细胞达到推荐的最大细胞密度之前定期进行传代培养。为每个细胞系绘制生长曲线,对于测定该细胞系的生长特性是必要的。

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